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HBV全基因組克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立
作者：趙艷芳，閆永平，蘇海霞，王安輝，張磊，張景霞，門可，徐德忠【關(guān)鍵詞】 肝炎病毒,乙型；基因組,病毒；克隆,分子；轉(zhuǎn)染；細(xì)胞培養(yǎng)；基因表達(dá)
【Abstract】 AIM: To construct a new cell culture system for producing HBV in vitro.METHODS: Fulllength HBV DNA was cloned into pcDNA3 vector (named pcDNA33HBV). HepG2 cells were transfected with pcDNA33HBV and screened with antibiotic G418. HBsAg and HBeAg were identified by ELISA and HBcAg was identified by immunocytochemical staining. S gene mRNA expression was tested by RTPCR and HBV DNA in the supernatant of transfected cells was tested by PCR. RESULTS: The plasmid pcDNA33HBV was constructed successfully. After stable transfection, HBsAg and HBeAg could be detected in the supernatant of transfected cells. HBcAg positive staining was located mainly in the cytoplasm. S gene mRNA expression was verified. S gene and preS gene could be detected in the supernatant by RTPCR. The copies of HBV genome can reach 1×108 copies/L detected by realtime quantitative PCR. CONCLUSION: Recombinant plasmid pcDNA33HBV could be expressed, transcribed and replicated in HepG2 cells. This transfectionbased cell culture system could produce high copies of HBV genome.
【Keywords】 hepatitis B virus; genome, viral; cloning, moleculor; transfection; cell culture; gene expression
【摘要】 目的： 建立HBV體外細(xì)胞培養(yǎng)體系. 方法： 構(gòu)建HBV全基因克隆質(zhì)粒pcDNA33HBV，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，G418篩選. ELISA檢測細(xì)胞上清液HBsAg，HBeAg的表達(dá)，免疫組化檢測細(xì)胞內(nèi)HBcAg的表達(dá)，RTPCR檢測細(xì)胞S基因mRNA的表達(dá)，PCR檢測細(xì)胞上清液DNA. 結(jié)果： 成功構(gòu)建了HBV全基因克隆質(zhì)粒pcDNA33HBV，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2后，培養(yǎng)上清HBsAg，HBeAg陽性，細(xì)胞內(nèi)HBcAg呈核漿型分布，且以漿型分布為主. RTPCR證實(shí)有HBV S基因 mRNA 的表達(dá)，上清中HBV S及前S基因陽性，熒光定量PCR檢測顯示培養(yǎng)上清中HBV 滴度達(dá)1×108拷貝/L. 結(jié)論： 重組質(zhì)粒pcDNA33HBV能在HepG2細(xì)胞中表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制，該細(xì)胞培養(yǎng)體系能產(chǎn)生較高水平的HBV.
【關(guān)鍵詞】 肝炎病毒，乙型；基因組，病毒；克隆，分子；轉(zhuǎn)染；細(xì)胞培養(yǎng)；基因表達(dá)
0引言
由于HBV宿主范圍窄、動(dòng)物模型缺乏，體外組織培養(yǎng)也一直沒有太大進(jìn)展，且不能在體外人工培養(yǎng)，制約了對(duì)HBV的研究［1］. 將HBV DNA轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞，建立表達(dá)HBV的體外培養(yǎng)細(xì)胞模型對(duì)研究HBV生物學(xué)特性和肝炎發(fā)病機(jī)制有重要意義［2-4］. HBV基因組呈雙鏈閉合環(huán)狀，基因結(jié)構(gòu)緊湊，其開放讀框分布于全長DNA，為使完整的轉(zhuǎn)染基因能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，目的基因的長度要大于一個(gè)HBV DNA單元［5-6］. 我們構(gòu)建3倍HBV基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)病毒蛋白的細(xì)胞模型，并研究其產(chǎn)生HBV的水平.
1材料和方法
1.1材料HBV全基因亞克隆載體pUC193HBV為pUC19在EcoRⅠ及HindⅢ位點(diǎn)中插入頭尾相連的HBV（adr亞型）三連體，由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所張秋博士惠贈(zèng)，保存在大腸桿菌DH5α中. 真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3由第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室趙晶博士惠贈(zèng)；人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（HepG2）由第四軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室惠贈(zèng)，本室傳代培養(yǎng)；內(nèi)切酶EcoRⅠ, HindⅢ, T4 DNA連接酶,Taq DNA聚合酶,反轉(zhuǎn)錄酶及DNA marker（TakaRa公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（西安市萊博科技發(fā)展有限公司）；LipofectamineTM 2000（Invitrogen公司）；DMEM培養(yǎng)基，G418（Gibco公司）；新生小牛血清（杭州四季青生物制品有限公司）；ELISA檢測試劑盒（上海科華
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